Diese Studie befasst sich mit den verschiedenen mutmaßlichen wechselseitigen Abhängigkeiten zwischen dem Zellzyklus und dem Verhalten von Säugetierzelllinien, basierend auf einer kontrollierten und physiologischen Synchronisierungs- und Kultivierungsmethode mit minimaler Artefakt-Anfälligkeit, sowie den zugehörigen Implikationen für zuverlässige Prozessanalytik und -kontrolle. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine bereits vorab etablierte experimentelle Anordnung zur Erzeugung synchronisierter Suspensionskulturen auf die humane Suspensions-zelllinie Human Embryonic Kidney cell line 293s adaptiert. Diese konnte somit unter annähernd physiologischen Bedingungen synchronisiert werden. Es waren umfang-reiche Optimierungen nötig, um hohe Überlebensraten sowie aggregationsfreies Wachstum zu erreichen und beizubehalten. Im Folgenden wurde diese Technik für Studien genutzt, um die potentielle Abhängigkeit der Transfektionseffizienz vom Zeitpunkt der Transfektion relativ zum Zellzyklus zu untersuchen. Diese Studien basieren auf Synchronisationsmethoden unter annähernd physiologischen Bedingungen. Das folgende synchrone Wachstum konnte dabei durch DNA-basierte Zellzyklus-Analysen und Wachstumsraten-Analysen belegt werden. Die Resultate deuten darauf hin, dass die sogenannten Abhängigkeiten der Transfektionseffizienz von dem Zellzyklus, die von anderen Forschungsgruppen publiziert wurden, nicht bestätigt werden können, wenn annähernd-physiologisch synchronisierte Kulturen genutzt werden. Folglich ist wahrscheinlich, dass die bislang veröffentlichten mutmaßlichen Zellzyklus-Abhängigkeiten Artefakte der nicht-physiologischen Methoden sind, die in diesen Studien verwendet wurden. Es ist anzumerken, dass diese Studie keine Aussage über potentielle Zellzyklus-Abhängigkeiten der Produktionsraten trifft; diese bedürfen weiterer zukünftiger Untersuchungen, potentiell unter Nutzung der hier etablierten Methoden. Um daran anknüpfend weiterführende zellzyklus-spezifische Untersuchungen und darüber hinaus zukünftig Online-Messungen zu ermöglichen, wurde ein neuartiger Ansatz gewählt. Es wurden zwei neue Derivate der häufig genutzten Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) Produktionszelllinie erzeugt, die ihren Zellzyklus- sowie Wachstumszustand in einer on-line auslesbaren Weise mittels Fluoreszenz anzeigen. Zu diesem Zweck wurden drei genetische FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) Konstrukte in zwei verschiedenen Kombinationen verwendet. In Übereinstimmung mit der Originalnomenklatur von Miyawaki et al. [C: mKO2-hCdt1(30/120), M: mVenus-hGeminin(1/110) und N: mVenus-hGeminin(1/60)] werden diese bezeichnet als CHO-K1 FUCCI CM und CN. Um quantitative und reproduzierbare Aussagen, basierend auf den Fluoreszenzeigenschaften, treffen zu können, wurden die folgenden Parameter eingeführt: Der Parameter iredn gibt an, welcher Anteil [%] der Zellen rot fluoresziert und steht im Verhältnis zur Gesamtanzahl fluoreszierender Zellen, zusammengesetzt aus der Anzahl von Zellen mit roter und grüner Fluoreszenz. Dieser relative Parameter ist somit weitgehend unabhängig von eventuell schwankenden Gesamt-Fluoreszenzintensitäten pro Zelle. Quantitative Analysen haben gezeigt, dass iredn gut mit dem Zellzyklusstatus von Kulturen korreliert (ausgedrückt als Anteil [%] der Zellen in der G1 Phase) und darüber hinaus in direktem Zusammenhang zur Wachstumsrate (μ) steht. Der Parameter iredn besitzt daher eine hohe Aussagekraft, setzt aber auch voraus, dass die Fluoreszenz einzelner Zellen bestimmt werden kann, um deren Anzahl in ein quantitatives Verhältnis zu setzen, weshalb Durchflusszytometrie hier die Methode der Wahl ist. Analog dazu basiert der Parameter iredtotal auf den Gesamt-Fluoreszenz-Intensitäten der Kultur und ergibt sich aus der Gesamt-Intensität der roten Fluoreszenz zur Summe der Intensitäten von roter und grüner Fluoreszenz. Dieses relative Maß erlaubt eine große Robustheit gegenüber variablen Zelldichten bzw. Gesamt-Fluoreszenzintensitäten der Kultur. iredtotal wird somit bestimmt durch die Anzahl der Zellen in den verschiedenen Zellzyklus-Phasen sowie deren Fluoreszenz-Intensität pro Zelle. Entsprechend ist der Parameter iredtotal weniger exakt als iredn, kann jedoch auch mit einfacheren Methoden (Fluoreszenzphotometer, Online-Messung) bestimmt werden. Wichtig ist für beide genannten Ansätze, dass die Fluoreszenz-Intensitäten (rot vs. grün) mit ausreichender Spezifizität (also niedrigem Übersprechen zwischen den Farbkanälen) und Genauigkeit detektiert und quantifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass iredtotal genutzt werden kann, um Änderungen der Wachstumsrate und wachstumslimitierende Bedingungen, hier exemplarisch in der Form von L-Glutamin-Mangel, frühzeitig zu detektieren. Dies wurde in Schüttelkolben- sowie Bioreaktor-Kulturen bestätigt. So wurden signifikante Signale für eine entstehende Limitierung mehrere Stunden früher erkannt als mit herkömmlichen Methoden (Zellzahl, Sauerstoff-Aufnahme-Rate). Daher wird die Verwendung von on-line oder at-line Fluoreszenzsonden für weitere Analysen und Prozesskontrolle von Säugetierzellkulturen empfohlen.
