Generierung eines konditionalen Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase-2-Knockout-Vektors,Generating A Conditional Dimethylarginine-Dimethylaminohydrolase-2-Knockout-Vector
Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
Erscheinungsjahr:
2008
Medientyp:
Text
Schlagworte:
610 Medizin, Gesundheit
44.38 Pharmakologie
44.39 Toxikologie
ddc:610
Beschreibung:
Im Herzkreislaufsystem stellt Stickstoffmonoxid (NO) einen zentralen Botenstoff dar. NO wird durch NO-Synthasen aus L-Arginin gebildet. Endogen vorkommendes asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) kann die physiologische Bildung von NO stören. Erhöhte ADMA-Plasma-Konzentrationen sind ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Ereignisse und Tod. ADMA wird überwiegend durch die Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) abgebaut, von der 2 Isoformen (DDAH-1 und DDAH-2) mit unterschiedlicher Gewebeverteilung bekannt sind. Um die Funktion der beiden DDAH-Isoformen, die ein interessantes Ziel für therapeutische Optionen darstellen besser untersuchen zu können, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen Genvektor für einen konditionalen Knockout der DDAH-2 zu generieren und die Integrität des Vektors zu überprüfen. Hierzu wurde ein Vektor generiert, der homologe Sequenzen des DDAH-2-Gens bzw seiner Umgebung besitzt, das mit einer Neomycin-Kassette als „positiver Selektionsmarker“, einer Diphterietoxin-Kassette als „negativer Selektionsmarker“ und drei loxP sites, die den kodierenden Bereich des Gens und die Neomycinresistenz-Kassette flankieren, ausgestattet ist. Die loxP sites sollten späteres selektives Ausschneiden des Gens bzw der Neomycinresistenz-Kassette erlauben. Durch das angewendete Cre/loxP-System bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, das Enzym flexibel in verschiedene Gewebe und zu verschiedenen Zeiten zu „inaktivieren“ und somit wertvolle Information für das bessere Verständnis des ADMA-DDAH-Stoffwechsels zu gewinnen. Wegen der Wichtigkeit der Orientierung der loxP sites wurden alle Elemente sequenziert. Anschließend wurde die prinzipielle Funktionalität des Vektors mit seinen loxP sites durch einen Expressionversuch in Cre-exprimierende Bakterien bestätigt. Der Targeting-Vektor wurde anschließend in Mausstammzellen (ES-Zellen) elektroporiert. Aus der Blastozysteninjektion der ES-Zellen und Implantation in scheinschwangere Mäuse sind chimäre Mäuse hervorgegangen, deren Verpaarung mit Wildtypmäusen nun wiederum Mäuse hervorgebracht hat, die heterozygot für den konditionalen K.O. sind. Erste Mäuse der F2 Generation mit konditionalem DDAH-2-K.O. stehen nun für weitere Untersuchungen und Verpaarungen mit den entsprechenden Cre-Mäusen bereit. Somit wird es nun erstmals möglich sein, isoliert die Folgen einer DDAH-2-Defizienz im Tiermodell zu untersuchen.