Trennung und Analyse von Glycoproteinstrukturen mittels online und offline Lektinaffinitätschromatographie-MS und NMR-Spektroskopie,Separation and analysis of glycoprotein structures by means of online and offline lectin affinity chromatography-MS and NMR spectroscopy
Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
Erscheinungsjahr:
2019
Medientyp:
Text
Schlagworte:
Lektinaffinitätschromatographie
Glycoproteinstrukturen
glycan
separation
mass spectrometry
nuclear magnetic resonance
lectin affinity chromatograpy
540 Chemie
35.06 Computeranwendungen
35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
35.26 Massenspektrometrie
35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese
35.63 Kohlenhydrate
Magnetische Kernresonanz
Massenspektrometrie
Affinitätschromatographie
Trennung
Analyse
Lectine
Polysaccharide
Proteine
ddc:540
Magnetische Kernresonanz
Massenspektrometrie
Affinitätschromatographie
Trennung
Analyse
Lectine
Polysaccharide
Proteine
Beschreibung:
Inhaltsverzeichnis AbkürzungsverzeichnisIV 1Einleitung1 1.1Das Glycom1 1.1.1Biosynthese der Glycane2 1.1.2Vielfalt und Funktionsweise der Glycane4 1.2Lektine6 1.2.1Klassifizierung der Lektine8 1.2.2Interaktionen der Lektine in physiologischen Erkennungsprozessen9 1.2.3Multivalenz10 1.2.4N-Acetylneuraminsäure-bindende Lektine11 2Methoden12 2.1Methoden zur Trennung komplexer Glycangemische12 2.1.1Affinitätschromatographie13 2.2Analytik mittels gekoppelter Techniken14 2.2.1Entwicklung und Einsatzbereiche gekoppelter Techniken14 2.2.2LC-NMR-Spektroskopie15 2.2.3Massenspektrometrie in Glycoproteomics und Glycomics21 3Computer und Programmierung24 3.1Die Programmiersprache BASIC24 3.2Die Programmiersprache C++25 3.3Die Programmiersprache Matlab25 3.4Entstehung der seriellen Datenübertragung26 3.4.1Modems und RS23227 4Aufgabenstellung29 5Ergebnisse und Diskussion30 5.1Konzeption und Realisierung eines LC-NMR-Systems30 5.1.1Pumpensystem, Injektionsventil und Fraktionssammler30 5.1.2Magnetventil und Relaisbox31 5.1.3Affinitätssäulen32 5.1.4NMR-Spektrometer und LC-Flusskopf32 5.1.5Der Aufbau des LC-NMR-Systems32 5.2Entwicklung einer Software zur Steuerung des LC-Systems34 5.2.1Programmierung des PRC-Programms34 5.2.2Softwareentwicklung mit Hilfe von Visual Basic .NET37 5.2.3Integration des Fraktionssammlers in das LC-System44 5.3Programmierung in TopSpin45 5.3.1Aufnahme von NMR-Spektren zur Evaluation des LC-Systems45 5.3.2Programmierung eines AU-Programms46 5.4Experimente zur Validierung des LC-Systems47 5.4.1Druckaufbau im LC-System47 5.4.2online Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Experimente50 5.5Modellglycoprotein Fetuin59 5.5.1offline 1H-NMR-Experimente der Fetuinglycane62 5.5.2offline ESI-TOF-MS der Fetuinglycane66 5.5.3PGC-LC-MS der Fetuinglycane69 5.6online stop-flow Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Experimente72 5.7offline Lektinaffinitätschromatographie-Experimente77 5.7.1offline Lektinaffinitätschromatographie-MS mit N Acetylneuraminsäure78 5.7.2offline Lektinaffinitätschromatographie-MS mit Fetuinglycanen81 5.7.3offline Lektinaffinitätschromatographie-NMR-Spektroskopie91 5.8Korrelation mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate92 5.8.1Konstruktion eines Models zur Berechnung von lsqnonneg-Fits93 5.8.2Auswertung der lsqnonneg-Korrelationskoeffizienten97 5.9Ausblick107 6Zusammenfassung108 7Summary111 8Experimenteller Teil114 8.1Programmieren in Matlab114 8.1.1Import von NMR-Daten114 8.1.2moving window-Funktion114 8.1.3Generierung von SUGABASE-Daten116 8.1.4Erstellung artifizieller N-Glycane116 8.1.5Erstellung der peak picking-Daten für automatisierte Beschriftungen125 8.1.6Vergleich eigener Spektren mit simulierten SUGABASE-Spektren125 8.1.7automatisierter Export von Bildern mit FIG_2_EPS126 8.1.8Basislinienkorrektur126 8.1.9Import und Auswertung der offline-MS-Daten (Masshunter)127 8.1.10Import und Auswertung der offline-MS-Daten (DataAnalysis)128 8.1.11Ausgleichungsrechnung mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate132 8.2Origin135 8.2.1Kurvenanpassung der N Acetyl D glucosamin-Verdünnungsreihe135 8.3Allgemeine Arbeitsvorschriften136 8.3.1Entgasen von Wasser136 8.3.2tryptischer Verdau des Fetuins136 8.3.3Abspaltung der Fetuinglycane mittels PNGase F137 8.3.4RP-SPE-Chromatographie137 8.3.5Anreichern von Glycanen mit Carbon Micropipette Tips138 8.3.6Reinigung von well plates138 8.3.7Überführung von Proben zwischen well plates und NMR-Röhrchen138 8.3.8Entsalzen von Proben139 8.4Gerätespezifische Vorschriften140 8.4.1Einbau des LC-NMR-Flusskopfes140 8.4.2Ausbau des LC-NMR-Flusskopfes140 8.4.3Aufnahme und Prozessierung von NMR-Spektren141 8.4.4offline ESI-TOF-MS der Fetuinglycane146 8.4.5PGC-LC-MS der Fetuinglycane146 8.4.6offline Lektinaffinitätschromatographie147 8.4.7offline Lektinaffinitätschromatographie-Massenspektrometrie149 8.5Verwendete Materialien151 8.6Verwendete Chemikalien152 8.7Pufferlösungen152 8.8Verwendete Geräte153 8.9Verwendete Software154 8.10Modifizierte AU- und Pulsprogramme155 8.10.1prc_ts_lcnmr.vFINAL.cpp155 8.10.2zgesgp2D_3.ab164 8.10.3zgesgp2D_4.ab166 9Toxikologische Daten168 10Literaturverzeichnis169 11Danksagung183 12CURRICULUM VITAE185 13Erklärung186
Contents List of abbreviationsIV 1introduction1 1.1The Glycom1 1.1.1biosynthesis of glycans2 1.1.2Diversity and functioning of the glycans4 1.2lectins6 1.2.1classification of lectins8th 1.2.2interactions of Lectins in physiological recognition processes9 1.2.3multivalence10 1.2.4N-Acetylneuraminic acid binding lectins11 2methods12 2.1Methods for the separation of complex Glycan mixtures12 2.1.1affinity13 2.2Analysis by coupled techniques14 2.2.1Development and applications of coupled techniques14 2.2.2LC-NMR spectroscopy15 2.2.3Mass Spectrometry in Glycoproteomics and Glycomics21 3Computers and Programming24 3.1The BASIC programming language24 3.2The C ++ Programming Language25 3.3the programming language Matlab25 3.4origin of the serial data transmission26 3.4.1Modems and RS23227 4task29 5Results and discussion30 5.1Design and implementation of the LC-NMR system30 5.1.1Pump system, injection valve, and fraction collector30 5.1.2Solenoid valve and relay31 5.1.3affinity columns32 5.1.4NMR spectrometer and LC flow head32 5.1.5The structure of the LC-NMR system32 5.2Development of a software for the control of the LC system34 5.2.1Programming the PRC program34 5.2.2Software development using Visual Basic .NET37 5.2.3Integration of the fraction collector in the LC system44 5.3programming in TopSpin45 5.3.1Recording NMR spectra for the evaluation of the LC system45 5.3.2Programming an AU program46 5.4Experiments to validate the LC system47 5.4.1Pressure build-up in the LC system47 5.4.2on-line Lectin affinity chromatography NMR experiments50 5.5Model glycoprotein fetuin59 5.5.1offline 1H NMR experiments with fetuinglycans62 5.5.2offline ESI-TOF-MS with fetuinglycans66 5.5.3PGC-LC-MS of fetuinglycans69 5.6on-line stop-flow lectin affinity NMR experiments72 5.7offline Lectin affinity chromatography experiments77 5.7.1offline Lectin affinity chromatography-MS with N-acetylneuraminic78 5.7.2offline Lectin affinity chromatography-MS Fetuinglycanens81 5.7.3offline Lectin affinity NMR spectroscopy91 5.8Correlation with the method of least squares92 5.8.1Construction of a model for the calculation of lsqnonneg-Fits93 5.8.2evaluation of lsqnonneg correlation coefficient97 5.9outlook107 6Summary108 7Summary111 8experimental section114 8.1programming in Matlab 114 8.1.1Import of NMR data114 8.1.2moving window function114 8.1.3Generating data from SUGABASE116 8.1.4Creating artificial N-glycans116 8.1.5Creation of peak picking data for automated captions125 8.1.6Comparing own spectra with simulated spectra from SUGABASE125 8.1.7automated export of images with FIG_2_EPS126 8.1.8Baseline correction126 8.1.9Import and evaluation of offline-MS data (MassHunter)127 8.1.10Import and evaluation of offline-MS data (Data Analysis)128 8.1.11Adjustment computation using the method of least squares132 8.2Origin135 8.2.1Curve Fitting of N-Acetyl-D-glucosamine dilution series135 8.3General working instructions136 8.3.1Degassing of water136 8.3.2Tryptic digestion of fetuin136 8.3.3elimination of the fetuinglycans by PNGase F digestion137 8.3.4RP-SPE chromatography137 8.3.5enriching glycans with Carbon Micro Pipette Tips138 8.3.6cleaning well plates138 8.3.7Transferring samples between well plates and NMR tubes138 8.3.8Desalting of samples139 8.4Device-specific regulations140 8.4.1Installation of LC-NMR-flow head140 8.4.2Removal of LC-NMR-flow head140 8.4.3recording and Processing of NMR spectra141 8.4.4offline ESI-TOF-MS with Fetuinglycans146 8.4.5PGC-LC-MS of with Fetuinglycans146 8.4.6offline lectin affinity chromatography147 8.4.7offline Lectin affinity chromatography mass spectrometry149 8.5materials used151 8.6chemicals used152 8.7buffer solutions152 8.8equipment used153 8.9Used software154 8.10Modified AU and pulse programs155 8.10.1prc_ts_lcnmr.vFINAL.cpp155 8.10.2zgesgp2D_3.ab164 8.10.3zgesgp2D_4.ab166 9Toxicological data168 10bibliography169 11note of thanks183 12CURRICULUM VITAE185 13statement186