Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
Erscheinungsjahr:
2009
Medientyp:
Text
Schlagworte:
Lowe-Syndrom
OCRL1
PIP2
MPR300
Endozytosedefekt
ASB
EGF
Transferrin
610 Medizin, Gesundheit
44.48 Medizinische Genetik
X-Chromosom
Grauer Star
Geistige Behinderung
Nierenfunktionsstörung
ddc:610
X-Chromosom
Grauer Star
Geistige Behinderung
Nierenfunktionsstörung
Beschreibung:
Das Lowe-Syndrom (LS) ist eine X-chromosomal vererbte Multisystemerkrankung, die durch kongenitale Katarakt, selektive proximale Tubulopathie und mentale Retardierung gekennzeichnet ist. Mutationen im OCRL1-Gen führen zum LS. Das OCRL-Protein ist eine Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat [PtdIns(4,5)P2]-spezifische 5-Phosphatase, die PtdIns(4)P produziert und primär am Trans-Golgi-Netzwerk und an frühen Endosomen lokalisiert ist. PtdIns(4,5)P2 ist vor allem an der Plasmamembran zu finden, wo es als Ko-Rezeptor bei der Rekrutierung und Regulation von Plasmamembran-spezifischen akzessorischen Proteinen dient, und dadurch einen direkten Einfluss auf endozytotische Prozesse hat. Die Interaktion von OCRL mit für die Endozytose wichtigen Proteinen, wie Clathrin, AP-2, Rab5 und APPL1, sowie dessen Lokalisation an frühen endozytotischen Vesikeln lassen vermuten, dass eine durch OCRL vermittelte PtdIns(4,5)P2-Dephosphorylierung an der Plasmamembran eine wichtige Rolle bei der Rezeptor-vermittelten Endozytose spielen könnte. Dieser Annahme sollte in dieser Arbeit nachgegangen werden, indem Wildtyp-OCRL bzw. verschiedene Mutantenproteine exprimierende COS-7-Zellen und auch primäre Fibroblastenzellen von Patienten mit LS (LS-Fibroblasten) hinsichtlich ihrer Kapazität, verschiedene Liganden zu internalisieren, analysiert werden sollten. Mit Hilfe von Koimmunfluoreszenzfärbungen wurde zunächst die subzelluläre Verteilung verschiedener OCRL-Proteinvarianten nach ektopischer Expression in COS-7-Zellen untersucht. Wildtyp-OCRL ist prominent am Golgi-Apparat lokalisiert - diese Lokalisierung ändert sich durch eine katalytisch inaktive 5-Phosphatase-Domäne nicht. Im Gegensatz dazu scheint die ASH-Domäne von OCRL für die Golgi-Lokalisation essentiell zu sein. Durch Expression der konstitutiv-aktiven Form der GTPase Rac1 bzw. EGF-Stimulation wird ektopisch exprimiertes Wildtyp-OCRL an die Plasmamembran von COS-7-Zellen transloziert, was die Hypothese stützt, dass OCRL an endozytotischen Prozessen beteiligt sein könnte. Mittels immunzytochemischer Experimente wurde die Internalisierung der Fluoreszenz-markierten Liganden EGF und Transferrin in OCRL-überexprimierenden COS-7-Zellen analysiert. Während die Überexpression von OCRL-Proteinvarianten mit intakter 5-Phosphatase-Domäne eine verminderte Internalisierung von Transferrin zur Folge hatte, wurde die Transferrin-Aufnahme durch die Überexpression einer 5-Phosphatase inaktiven OCRL-Mutante nicht beeinflusst. Die Endozytose von EGF wurde durch keins der überexprimierten OCRL-Proteine verändert. Um die Auswirkungen einer OCRL-Defizienz auf endozytotische Vorgänge zu untersuchen, wurden acht LS-Fibroblastenzelllinien genutzt. Die jeweils ursächliche Mutation im OCRL1-Gen konnte in diesen Zelllinien molekulargenetisch identifiziert bzw. verifiziert werden, und die OCRL-Defizienz wurde mittels Western-Blot Analyse bestätigt. In den LS-Fibroblasten zeigte sich im Vergleich zu Kontrollfibroblasten keine veränderte Aufnahme von Fluoreszenz-markiertem EGF oder Transferrin. Endozytosestudien mit den radioaktiv-markierten Liganden Arylsulfatase B (ASB) und „Low density lipoprotein“ (LDL) ergaben, dass die LDL-Internalisierung in Kontroll- und LS-Fibroblasten gleich war, im Gegensatz dazu aber für die ASB eine um bis zu 65% reduzierte Internalisierung in LS-Fibroblasten nachgewiesen werden konnte. Diese verminderte ASB-Aufnahme geht nicht auf eine reduzierte Anzahl der entsprechenden Rezeptoren (Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren) in den OCRL-defizienten Fibroblastenzellen zurück. Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse vermuten, dass OCRL-abhängige Veränderungen der PtdIns(4,5)P2-Homöostase das Rezeptor-Trafficking an der Plasmamembran auf unterschiedliche Weise beeinflussen können. So könnte eine durch eine OCRL-Defizienz bedingte Erhöhung der PtdIns(4,5)P2-Konzentration zu einer intrazellulären Umverteilung der Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren führen, wodurch möglicherweise die Konzentration dieser Rezeptoren im Recyclingpool zur Plasmamembran verringert wird und eine verminderte ASB-Aufnahme resultiert. Eine durch eine OCRL-Überexpression bedingte Erniedrigung der zellulären PtdIns(4,5)P2-Konzentration könnte demgegenüber zu einer ineffizienten Rekrutierung von für die Transferrin-Internalisierung essentiellen akzessorischen Proteinen an die Plasmamembran führen, was eine verminderte Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Transferrin nach sich ziehen könnte.