Anhang - Entwicklung von LC-MS/MS-basierten Assays zur Quantifizierung und Charakterisierung der Adsorption von Analyten an Oberflächen

Dieser Datenupload ergänzt die Dissertation „Entwicklung von LC-MS/MS-basierten Assays zur Quantifizierung und Charakterisierung der Adsorption von Analyten an Oberflächen“.
Er enthält die zugehörigen Anhangsdaten, Skripte sowie Rohdaten, die im Rahmen der experimentellen Arbeiten generiert wurden. 

Inhalt:

• Anhangstabellen S1–S10: Übersicht und Beschriftungen siehe Begleitdokument Information-S-Tabellen.
• APS-Assay-Skript: Python-Code zur automatisierten Auswertung (APS-Assay_Skript.py).
• Massenspektrometrische Rohdaten (.raw) und Datenbanksuchen (.msf): Zuordnung der Proben siehe Probenzuordnung (Excel-Datei). Enthalten sind Messdaten zu:
  • 1,5-mL-Gefäßen (Hersteller A, m-PP-Platte)
  • 96-Well-Platten (Hersteller A)

Die Datensätze dienen der Nachvollziehbarkeit und Wiederverwendbarkeit der in der Dissertation beschriebenen Ergebnisse.
Zur korrekten Interpretation der Daten wird empfohlen, zusätzlich die Dissertation sowie die Dokumente Information-S-Tabellen und Probenzuordnung zu konsultieren.

Zusammenfassung: Die Adsorption von Molekülen an Oberflächen ist eine unterschätzte Fehlerquelle in der Analytik. Sie kann zu Probenverlusten und falschen quantitativen Ergebnissen führen. Dieses Problem betrifft jeden Analyten. In den verschiedenen Omics-Disziplinen ist dieses Problem besonders relevant, da im Gegensatz zur Analytik einzelner oder weniger Analyten der Einsatz interner Standards nicht möglich ist. Das Ausmaß der Adsorption wird maßgeblich durch die Kombination aus verwendeter Oberfläche (feste Phase) und der Zusammensetzung des Lösungsmittels (flüssige Phase), in dem der Analyt gelöst ist, sowie durch die chemischen Eigenschaften des Analyten bestimmt.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung standardisierter Assays, mit denen sich Adsorptionsprozesse von Molekülen abhängig von der flüssigen und der festen Phase reproduzierbar charakterisieren und quantifizieren lassen. Typische feste Phasen, mit denen gelöste Analyten während der Probenvorbereitung in Kontakt kommen, sind Probengefäße, Mikrotiterplatten oder Pipettenspitzen, die sich in ihren chemischen und physikalischen Oberflächeneigenschaften unterscheiden. Als Sonden zur Charakterisierung der Wechselwirkungen dienten tausende tryptische Peptide eines Referenzgemisches, mit einer großen Vielfalt physikochemischer Eigenschaften. Diese wurden vor und nach Kontakt mit festen Oberflächen direkt mittels quantitativer, differentieller Bottom-up-Proteomik unter Nutzung der Flüssigkeitschromatographie-gekoppelten Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Eine Adsorption lag immer dann vor, wenn nach der Inkubation eine signifikante Abnahme der Menge eines Peptids in der flüssigen Phase gemessen wurde. Durch den Blick auf die chemischen Eigenschaften wie Länge, Hydrophobizität und Ladung der adsorbierten Peptide konnten Rückschlüsse auf die Art und Stärke der Wechselwirkung gezogen werden. Der entwickelte Assay wurde als „Adsorption-Properties-of-Surfaces-Assay“ (APS-Assay) bezeichnet.

Der APS-Assay wurde getestet, indem die Adsorptionseigenschaften der Oberflächen von kommerziell erhältlichen Probengefäßen aus Polypropylen (PP) und Glas (G) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels (0,1 % Ameisensäure in Wasser) untersucht wurden. PP-Gefäße wiesen eine signifikante Adsorption zahlreicher hydrophober Peptide aufgrund hydrophober Wechselwirkungen auf, während einige modifizierte PP-Oberflächen keine Adsorption zeigten. Bei Glasgefäßen konnte eine starke Adsorption einer großen Zahl von Peptiden festgestellt werden, die unter anderem durch elektrostatische Wechselwirkungen bedingt war. Die Folgen dieser Adsorption ließen sich anhand veränderter Proteinabundanzen in der differentiellen quantitativen Proteomanalytik nachweisen, was zu Fehlinterpretationen biologischer Prozesse führte. Die Analyse der chemischen Eigenschaften der adsorbierten Peptide ergab, dass auch die Sekundärstruktur die Adsorption der Peptide an Oberflächen beeinflusst. Konformationsabhängige Effekte wurden experimentell mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie bestätigt und bei der Etablierung des APS-Assays berücksichtigt. Zur Automatisierung der Auswertung wurde ein Python-basiertes Skript entwickelt, das eine effiziente und umfassende Bewertung der Adsorptionsprozesse ermöglicht. Auf Grundlage der APS-Assay-Ergebnisse wurde ein vereinfachter, Multiple Reaction Monitoring-basierter „Fast-Assay“ entwickelt. Durch die gezielte Auswahl weniger Peptide aus dem Referenzgemisch mit eindeutigen chemischen Eigenschaften ermöglicht dieser eine schnelle Quantifizierung der Adsorption durch Wechselwirkungen an unterschiedlichen Oberflächen in Abhängigkeit von den verwendeten Lösungsmitteln.

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass Adsorption ein selektiver, physikochemisch determinierter Prozess ist, der bei der experimentellen Planung berücksichtigt werden sollte. Der APS-Assay und der darauf aufbauende Fast-Assay stellen universelle Werkzeuge dar, mit denen sich optimale Kombinationen von Lösungsmittel- und Oberflächenbedingungen ermitteln lassen, um den Verlust von Analyten durch Adsorption zu minimieren.