Neue Ansätze zur systembiologischen Untersuchung der Mitochondrien und des Metabolismus in tierischen Zellkulturen

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Autor/in:
Beteiligte Person:
  • Zeng, An-Ping
Verlag/Körperschaft:
Hamburg University of Technology
Erscheinungsjahr:
2014
Medientyp:
Text
Schlagworte:
  • Zellkompartimentierung
  • Mitochondrien
  • kompartimentierter Stoffwechsel
  • CHO-K1-Zellen
  • Zellaufschluss
  • Mitochondrienisolation
  • Mikrofluidik
  • cell compartmentalization
  • mitochondria
  • compartmentalized metabolism
  • CHO-K1 cells
  • cell disruption
  • mitochondria isolation
  • microfluidics
  • 42.15:Zellbiologie
  • Mitochondrium
  • Zellaufschluss
  • Mikrofluidik
  • Systemintegration
  • Stoffwechsel
  • 42.15
  • 570
Beschreibung:
  • Metabolomische Analysen bilden einen entscheidenden Schritt zum Verständnis zellulärer Funktionen auf genomischer Ebene. Verlässliche metabolomische Analysen unter physiologischen oder in vivo Bedingungen werden insbesondere für systembiologische Untersuchungen zur Beschreibung der Interaktionen von Stoffwechselreaktionen und ihrer Dynamik benötigt. Während genomische, proteomische und transkriptomische Daten heutzutage mit hoher Präzision generiert werden können, gestaltet sich die Bestimmung von Metabolitenprofilen nach wie vor schwierig. Dies liegt einerseits an den schnellen Umsatzraten, den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stoffwechselwegen und der chemischen Diversität von Metaboliten. Auf der anderen Seite bildet die Kompartimentierung des Stoffwechsels tierischer Zellen eine große Herausforderung, da hierdurch eine dynamische Spannbreite von Metabolitkonzentrationen innerhalb des Zytosols und der Mitochondrien vorliegt. Zur Bewältigung der Schwierigkeiten der Zellkompartimentierung wurde in der vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen, die schnelle und effiziente Separation zytosolischer und mitochondrialer Kompartimente von Säugetierzellen durch neue technologische Ansätze sowohl im Makromaßstab als auch im Mikromaßstab, auf einem „Lab-on-a-Chip“ (LoaC), zu erzielen. Wegen ihrer beachtlichen industriellen Bedeutung wurde innerhalb dieser Forschungsarbeit die Suspensionszelllinie CHO-K1 als Modell-organismus verwendet. Für die Mitochondrienisolation im Makromaßstab wurden verschiedene Zellaufschlussverfahren modifiziert und getestet. Die Effizienz und Sensitivität einer jeden Methode wurden durch die Messung der Mitochondrienausbeute und der Integrität isolierter Mitochondrien bestimmt. Hierbei konnten die höchsten Ausbeuten intakter Mitochondrien für einen Zellaufschluss mittels Ultraschall und anschließender differentieller Zentrifugation erzielt werden. Parallel zu den makroskopischen Methoden wurde als Kooperationsprojekt ein Mikrochipsystem entwickelt, das innerhalb weniger Sekunden eine vollständige Probenverarbeitung (einschließlich Zellaufschluss) für metabolische Analysen ermöglichen sollte. Der Prototyp des LoaC wurde innerhalb dieser Arbeit erfolgreich in einen Bioreaktor integriert und für eine Gesamtdauer von 18 h betrieben. Eine kontinuierliche Probenahme konnte hierbei mittels Überdruck realisiert werden. Neben dynamischen Pulsexperimenten wurde durch dieses Mikrochip-Bioreaktor-System eine effiziente Separation der Zellen vom extrazellulären Medium erzielt. Durch eine vorangestellte Zelllyse mittels Digitonin und die anschließende Abtrennung des freigesetzten Zytosols von den verbleibenden zellulären und mitochondrialen Kompartimenten, erwies das integrierte Mikrochipsystem großes Potential, um die Limitierungen zur Analyse des kompartimentierten Metabolismus zu überwinden. Im letzten Teil der Arbeit wurden die CHO-K1 Zellen für systembiologische Untersuchungen in einem geregelten Kleinmaßstab-bioreaktor kultiviert. Hierfür wurden neben Batch-Verfahren ebenfalls kontinuierliche Kultivierungen von Mischpopulationen durchgeführt und detaillierte extrazelluläre Metabolitanalysen mittels LC-MS vorgenommen. Darüber hinaus wurden durch konfokale und hochauflösende STED-Mikroskopie die Mitochondrienstrukturen und die Verteilung mitochondrialer Proteine in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen analysiert. Zudem konnte der relative Gehalt stoffwechselrelavanter Enzyme intrazellulär durch Einsatz der ELISA-Technologie bestimmt werden. Zur Untersuchung der Abhängigkeit meta-bolischer Reaktionen vom Zellzyklus wurden Kultivierungen synchronisierter Zellen erfolgreich durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen im Vorfeld aus heterogenen Populationen mittels Elutriationszentrifugation in der G1- bzw. der S-Phase angereichert. Die Synchronität über den Zeitraum einer Batch-Kultivierung konnte mittels durchflusszytometrischer Analysen zur Bestimmung des DNA-Gehalts und des Zelldurchmessers sowie durch die erfolgreiche Applikation eines at-line Mikroskops zur kontinuierlichen Bestimmung der Zellzahl verfolgt werden. Metabolische und mikroskopische Untersuchungen synchronisierten Zellen wurden parallel dazu durchgeführt und mit den Daten der Kultivierungen von Mischpopulation verglichen. Unter anderem durch deutlich erhöhte Verbrauchsraten der Hauptsubstrate Glukose und L-Glutamin in der S-Phase und eine versetzt eintretende erhöhte Bildung von Laktat während der G1-Phase, konnte eine Zellzyklusabhängigkeit des Metabolismus gezeigt werden.
Lizenzen:
  • info:eu-repo/semantics/openAccess
  • http://doku.b.tu-harburg.de/doku/lic_mit_pod.php
Quellsystem:
TUHH Open Research

Interne Metadaten
Quelldatensatz
oai:tore.tuhh.de:11420/1168